软骨RNA提取试剂盒
分类: 最上层
发布时间: 2018-03-20 18:36
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货号: | 70401 |
供应商: | 上海研卉生物科技有限公司 |
数量: | 现货 |
规格: | 50次 |
软骨RNA提取试剂盒使用说明
产品及特点 | 本产品专门从各种软骨组织样品中快速提取总RNA的试剂盒,它能有效克服传统TRIzol方法提取软骨组织RNA时,十分容易产生糖蛋白和酸性多糖污染这一缺点。 能有效去除糖蛋白、粘蛋白污染,OD260/280一般均在1.9以上。 RNA产率一般为5-15 μg/100 mg。 操作简单,整个提取过程一般只需要10多分钟。 得到的RNA可以直接用于RT-PCR、Northern杂交、mRNA纯化、Primer Extension、RNA Protection、in vitro translation等研究。 | ||||||||||||
规格及成分 |
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运输及保存 | 常温运输,4℃保存,有效期一年。 | ||||||||||||
自备试剂 | 氯仿、75%乙醇、RNase-free水。 | ||||||||||||
使用方法 | 先将50-200 mg新鲜或冷冻的软骨组织液氮研磨成粉,加入1 mL溶液A(使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解)溶解,然后将研磨物转移到新的1.5 mL离心管中, 振荡混合30秒。也可以将软骨组织剪碎后与溶液A一起匀浆,再转移到离心管中。 在装有研磨物/匀浆物的离心管中加入0.3 mL的溶液B,振荡器振荡30秒混匀。注意:振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。 加入0.2 mL自备氯仿,振荡器振荡30秒混匀。注意:振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。 室温12000-15000×g离心2-5分钟。 将上清液(约0.8 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中,下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质,避免触及或吸取。最好留下100 uL上清液不取。 在上清液中加入0.5 mL的溶液C,振荡器振荡30秒混匀。注意:振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。 加入0.2 mL的自备氯仿,振荡器振荡30秒混匀。注意:振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。 室温12000-15000×g离心3分钟,两相间将有白色膜状物(蛋白质)形成。 将上清液(约1 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中,避免触及或吸取有机相及其上面的白色膜状物。 在上清液中加入0.5倍体积的溶液D,振荡器振荡30秒混匀,此时溶液呈白色浑浊状。注意:振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。 室温12000-15000×g离心5-10分钟,RNA将在管底形成白色沉淀(约黄豆大小)。如果组织样品量少或需要提高RNA回收率,也可以延长离心时间到20-30分钟。 在离心管中加入1mL 75%的乙醇,振荡器上振荡混匀30秒。 室温12000-15000×g离心5分钟,RNA将在管底形成细小沉淀(约芝麻大小)。 重复上步75%的乙醇洗涤一次,RNA将在管底形成细小沉淀。 小心吸弃上清液,注意不要吸弃RNA沉淀。 再短暂快速离心,用移液枪小心吸弃残留液。注意:不要吸弃沉淀。此步将有效去除残留的乙醇,否则后续反应会受到影响。 加入适量(一般为20-50 μL)RNase-free水使RNA沉淀溶解,存放于-80℃或立即使用。千万不要用真空离心法使RNA沉淀过于干燥,否则RNA将变得十分难溶。 检测 RNA完整性的电泳检测 如果需要做Northern杂交,强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳,因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques,28:414,2000)。如果是简单检测,可以使用TAE或SuperBuffer-2 DNA/RNA两用快速电泳液,但文献报道必须使用变性上样液(BioTechniques,9:558,1990)。普通DNA上样液不含变性剂,也没经过去RNase处理,所以最好不要使用。 尤其需要注意的是不要使用TBE进行RNA电泳,因为TBE所含硼酸是研究多糖的经典方法——硼酸络合法中的关键成分,硼酸通过与RNA核糖中的羟基发生络合反应,形成RNA分子内或RNA分子间的络合复合物,使同样长度的RNA具有不同的泳动速度,电泳条带弥散,同时有大的RNA络合复合物迟留在加样孔中(一般会误以为是基因组DNA污染)。RNA分子内或RNA分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA的数量比例有关,而RNA样品中污染的其他多糖也会参与此反应,使硼酸对RNA电泳的影响更复杂,所以TBE对RNA电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行,最好是避免使用。 由于动物细胞中70-80%的RNA为rRNA,后者又由28S(约4800 nt),18S(约1900 nt)和5.8S(约120 nt)三种组成,所以变性胶电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合EB的数量成正比(当然还与RNA的二级结构有关,双链部分结合能力比单链部分强),所以28S rRNA条带的荧光强度一般比18S rRNA条带的荧光强度强1.5-2.3倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解(因为大的RNA被酶降解的可能更大)。 RNA产量产率测定 将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中(pH在7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260 RNA=40 μg/mL),进而计算出RNA的产量(浓度×体积)和产率(RNA产量/组织用量)。 注意不要将RNA稀释在DEPC水中检测OD260和OD280,否则光吸收比在TE中测得的低10%-15%。 RNA纯度测定 无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关),OD260/OD230一般在2.0-2.3之间,如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染,但一般不影响RT-PCR等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除,DNA和多糖污染可以分别用DNA Erasol 和PS Erasol去除。 |
温馨提示:不可用于临床治疗。